Dag2

Under denna dag gjordes PCR, kontrollelektrofores och klyvning av plasmid.

Vi fick reda på från första laborationen att vår plasmid har renats från protein föroreningar genom att titta på kvoten som var 1,86. Idag gjorde vi PCR för att få informationen om det finns LL37 gen i vektor eller inte? Laborationen började med förbredning av en mastermix innehållande PCR-buffert, dNTP (byggstenar), Upper primer, lower primer, H₂O och Taq DNA-polymeras. Sedan fördelade vi master mix i tre olika rör. Denna Master mix förbereddes i ett rent rum (utan någon DNA template och känd gen som LL37) för att minska kontamineringen. Rören stoppades i PCR maskinen och efter det gjorde vi gelelektrofores och fick resultat men på grund av ett litet fel som vi gjorde i första labb tillfälle att spara plasmiden i kylen då en annan laborants plasmid användas under dagen och det var tur att vi fick ett bra resultat som visade att LL37 gen finns och primerna har bundit till dess specifika mål sekvenser.

 Hur blev resultatet? Om du tycker att resultatet blev bra; vilka kontroller har du som gör att du kan lita på resultatet?

På bilden ser vi resultat som är perfekt! Då PCR reaktionen fungerade och PCR produkten amplifikerat som kontrollerades senare med elektrofores tillsammas med positiv och negativ kontroll, plasmidlösning (oklyvd Plasmid) samt markör III och IX.

Brunnarnas innehåll från vänster till höger :
Brunn 1: Markör III

Brunn 2: Plasmid lösning

Brunn 3: Negative Kontroll

Brunn 4: PCR (eget prov)

Brunn 5 :Positive Kontroll

Brunn 6 : Markör IX

Man använder Positivt och negativt kontroll för att jämföra resultatet och i bilden visar Positiv kontroll ett band som är lika stor som PCR vilket påvisar att plasmid har genen LL37 samt elektrofores fungerade. Det finns inget band i negativt kontrollen och detta innebär att det inte finns någon Cary over kontamination. Eget prov påvisar en tidligt band på gelen och med jämförelse mot markörer med kända storleker då ser vi att vårt prov innehåller LL37 gen med ungefär 550bp. En annan tidligt band av oklyvd plasmid ses på bilden vilket innebär att plasmiden finns i sin supercoild struktur (CCC Plasmid).

Om resultatet blev misslyckat; vad tror du är den troligaste orsaken till att det misslyckades?

Om resultat blev misslyckat då skulle kromosomalt DNA synas högst upp på gelen och RNA längst ner på gelen.

. Är det något du funderar på som du vill att vi tar upp vid genomgången nästa labb dag eller vid labuppföljningen?

Nej , ingenting.