Dag 4

Syftet av den här laborationen är stringenstvätt och detektion av LL37 gen.
 
 Stringenstvätt utfördes två gånger vilket har syfte att ta bort dem proben som har bundit ospecifikt till målsekvens,och stringens i sin tur påverkar  på jon styrka samt temperaturen. Efter stringenstvätt tillsatte vi antikroppar till membranet som var märkta med DIG.Antikroppar konjugerades med ett enzym (alkalisk fosfatas) sen tillsattes substratet till enzymet som omvandlade substrat till en färg produkt. Detta ger information om att proben har bundit någonstans på membranet. Därefter tittar man på resultatet men i våren fall det syntes ingenting.

 Det gick jättebra i alla tre dagar  men vi misslyckades den sista dagen för att det membran som vi detekterade gav inget resultat, det kom ingen band på membranet. Detta kan bero på olika orsaker en av de är att hybridisering lösningen som vi använde läckte ut eller det kan också bero på att vid hybridisering steg proben kvantitet sjönk under pippetering.

Både metoderna (PCR och Southern blott) har för syfte att detektera LL37 genen som finns i plasmiden, men skillnaden är att vi använder primer vid PCR och proben vid Southern blott som binder bara till målsekvens. PCR är lätt att utföra som innehåller mindre steg än Southern blott som är en tidskrävande process med flera steg som man lätt glömmer och om man missar något av dessa steg då påverkar det kraftigt på resultat. Men jag tycker att det finns stor risk för kontaminering i PCR eftersom master mix måste göras i ett rent rum för att undvika kontaminering.

Eftersom vi misslyckades med våran resultat i sista dagen lärde jag mig att arbeta noggrant vid varje steg under laborationen samt kolla  noggrant på pipettering. Jag lärde mig att man måste förberedda varje steg inför laborationen.

Dag 3

I denna dag utförde vi andra metoder för att detektera LL37 genen som elektrofores, Southern Blott DNA fixering till membranet med UV bestrålning, inmärkning av LL37 gen med DIG-dUTP (Random priming),,prehybridisering samt hybridisering.

Elektrofores utfördes för separationen av insert från vektorn och detta görs på liknande sätt som tidigare och resultatet dokumenterades genom att gelen belystes med UV-ljus och fotograferades.   Blotting används för överföring av DNA från gelen  till nylon membran. Överföringen sker i en hög bestående av flera lager av olika komponenter ( pappershandduk, Watmans papper, gelen, membranet och plastfolie). Efter blotting fixerades DNA på membranet genom att det belyses med UV-ljus, detta görs för att DNA ska sitta fast på membranet. För att kunna detektera LL37 genen  kräver en probe  inmärkning (märkt med DIG-dUTP) som tillverkades genom random priming. 
Därefter gjorde vi en prehybridisering vilket innebär att man tillsätter en blockeringsreagens som blockerar de positiva laddningarna på membran för att märkt proben binder specifikt till LL37 gen, annars binder de ospecifikt till membran. Sedan gjorde vi hybridisering för att proben kunna binda specifikt till målsekvens och låt den övernatt.

Dag2

Under denna dag gjordes PCR, kontrollelektrofores och klyvning av plasmid.

Vi fick reda på från första laborationen att vår plasmid har renats från protein föroreningar genom att titta på kvoten som var 1,86. Idag gjorde vi PCR för att få informationen om det finns LL37 gen i vektor eller inte? Laborationen började med förbredning av en mastermix innehållande PCR-buffert, dNTP (byggstenar), Upper primer, lower primer, H₂O och Taq DNA-polymeras. Sedan fördelade vi master mix i tre olika rör. Denna Master mix förbereddes i ett rent rum (utan någon DNA template och känd gen som LL37) för att minska kontamineringen. Rören stoppades i PCR maskinen och efter det gjorde vi gelelektrofores och fick resultat men på grund av ett litet fel som vi gjorde i första labb tillfälle att spara plasmiden i kylen då en annan laborants plasmid användas under dagen och det var tur att vi fick ett bra resultat som visade att LL37 gen finns och primerna har bundit till dess specifika mål sekvenser.

 Hur blev resultatet? Om du tycker att resultatet blev bra; vilka kontroller har du som gör att du kan lita på resultatet?

På bilden ser vi resultat som är perfekt! Då PCR reaktionen fungerade och PCR produkten amplifikerat som kontrollerades senare med elektrofores tillsammas med positiv och negativ kontroll, plasmidlösning (oklyvd Plasmid) samt markör III och IX.

Brunnarnas innehåll från vänster till höger :
Brunn 1: Markör III

Brunn 2: Plasmid lösning

Brunn 3: Negative Kontroll

Brunn 4: PCR (eget prov)

Brunn 5 :Positive Kontroll

Brunn 6 : Markör IX

Man använder Positivt och negativt kontroll för att jämföra resultatet och i bilden visar Positiv kontroll ett band som är lika stor som PCR vilket påvisar att plasmid har genen LL37 samt elektrofores fungerade. Det finns inget band i negativt kontrollen och detta innebär att det inte finns någon Cary over kontamination. Eget prov påvisar en tidligt band på gelen och med jämförelse mot markörer med kända storleker då ser vi att vårt prov innehåller LL37 gen med ungefär 550bp. En annan tidligt band av oklyvd plasmid ses på bilden vilket innebär att plasmiden finns i sin supercoild struktur (CCC Plasmid).

Om resultatet blev misslyckat; vad tror du är den troligaste orsaken till att det misslyckades?

Om resultat blev misslyckat då skulle kromosomalt DNA synas högst upp på gelen och RNA längst ner på gelen.

. Är det något du funderar på som du vill att vi tar upp vid genomgången nästa labb dag eller vid labuppföljningen?

Nej , ingenting.